Сэм Винчестер родился 2 мая 1983 года в семье Джона и Мэри Винчестер. Сэм — второй ребёнок в семье, он младше своего брата Дина на 4 года. Дин — единственный, кому позволено называть его «Сэмми».
Сэм сильно отличается от своего брата Дина. Он более рационален, впечатлителен и, по-видимому, больше заинтересован в том, чтобы жить «нормальной» жизнью. Но, несмотря на это, очевидно, что он готов на всё ради Дина. Сэм был совсем маленьким, когда его мать была убита, поэтому он мало помнит об этом моменте своей жизни и, следовательно, менее заинтересован в охоте на демонов. В знак протеста против желания отца воспитать его как охотника за демонами Сэм покидает дом и поступает в Стэнфордский колледж, где знакомится с девушкой по имени Джессика и влюбляется в неё. Он ссорится с отцом, потому что тот был против его поступления в университет. Их отношения ещё долгое время будут далеки от идеальных, но в конце концов, они простят друг друга. Смерть любимой девушки вынуждает Сэма отправиться в дорогу с братом в поисках пропавшего отца. Однако для Сэма главным было отомстить Демону, виновному в смерти матери и Джессики, и лишь потом истребление сил зла и спасение людей стало для него смыслом жизни. В отличие от брата Сэм очень уважает закон, и любое противозаконное действие вызывает у него протест. Сэм не любит лгать и чувствует себя неловко, когда приходится это делать, даже во имя спасения человеческой жизни. Сталкиваясь с проблемой истребления «нечистой силы», Сэм всегда старается отыскать способ её решения, не прибегая к насильственным методам и не нарушая закон (хотя это не всегда удаётся), в то время как Дин находит самый простой выход и может, не задумываясь, убить человека, одержимого демоном или укушенного оборотнем. В отличие от Дина, любящего флиртовать с девушками в любой подходящий и не подходящий момент, Сэм не стремится заводить новые знакомства, ставя работу на первое место. Сэм сильно переживает из-за своих паранормальных способностей и возможной дальнейшей судьбы. Он боится, что может перейти на «сторону зла» и поэтому стремится помочь стольким людям, скольким сможет, чтобы изменить свою судьбу.
Сэм обладает способностями к телекинезу и предвидению, проявляющемуся в форме видений. Однако способность к телекинезу Сэм проявил лишь однажды в эпизоде «Ночной кошмар», в то время как видения у него бывают довольно часто. После открытия Адских врат, Сэм теряет способности к предвиденью. В четвертом сезоне приобретает способность изгонять демонов из одержимых и отправлять их в ад. В 16-ой серии, становится ясен источник его сил: он пьёт кровь Руби. В этой же серии он развивает свои способности до такой степени, что может причинять демонам боль и убивать их силой мысли. Однако после восстания Люцифера Сэм избавляется от зависимости от демонской крови. В заключительной серии 5-ого сезона он снова пьет демонскую кровь, для того, чтобы стать сильнее и заточить Люцифера в клетку.